Purification and kinetic characteristics of hepatic 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) from yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco [Sarı kedi balığı Pelteobagrus fulvidraco karaciğer 6-fosfoglukonat dehidrojenaz (6PGD)’ın saflaştırılması ve kinetik

ABSTRACT Objective: To purify and characterize hepatic 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGD) from yellow catfish and evaluate the effect of several metal ions (Cd2+, Cu2+ and Al3+) on the enzymatic activity in vitro. Methods: The 2’, 5’-ADP Sepharose 4B chromatography is used as the purification procedure; SDS-PAGE is used to assay the 6PGD purity and determine the molecular mass of the subunit; 6PGD activity is determined following rates of the conversion of NADP+ to NADPH at 340 nm. The optimal temperature, pH and ionic strength is determined; The substrates and product kinetic, effect of metal ions are studied. Results: The specific 6PGD activity is 5.75 U/mg, and its molecular weight is 50.1 kDa with a signal band. The optimum pH, temperature and ionic strength for the enzyme are pH 7.85, 60°C and 100 mM, respectively. The enzyme has the activation energy of 17.37 kcal/mol. The Km values of the enzyme for 6PGA and NADP+ are 169.3 µM and 91.1 µM, respectively. The Vmax values of 6PGD with 6PGA and NADP+ as the substrate are 5.1096 U/mg and 6.6776 U/mg, respectively. 6PGD is inhibited by NADPH in a competitive manner with the Ki value of 41.5 µM. The following metals, Cd2+, Cu2+ and Al3+ show inhibitory effects on the enzyme. Cd2+ shows inhibitory effects in a competitive manner. The IC50 values of Cd2+ and Cu2+ are 0.16, 0.41mM, respectively, but the Al3+ shows almost no effects on the enzymatic activity. Conclusion: The study can provide more information about purification and analysis of kinetic characterization of 6PGD in fish, and this is the first time that we study the in vitro influence of metal ions on 6PGD activity in fish. ÖZET Amaç: Bu çalışmanın amacı, hepatik 6-fosfoglukonat dehidrojenazı (6PGD), sarı kedi balığından saflaştırmak ve karakterize etmektir. Bununla birlikte, farklı metal iyonlarının (Cd2+, Cu2+ ve Al3+) enzim üzerine olan etkilerini incelemektir. Metod: Saflaştırma için 2’, 5’-ADP Sepharose 4B kromatografi prosedürü; 6PGD’nin saflığı ve moleküler ağırlığı için SDS-PAGE metodu; 6PGD aktivitesi ölçümü için NADP+ ’nın NADPH 340 nm’de ölçümü kullanılmıştır. Optimum ısı, pH ve iyonik güç bulunmuştur. Substratlar ve ürün kinetiği için metal iyonlarının etkisi çalışılmıştır. Bulgular: Özgül 6PGD aktivitesi, 5.75 U/mg, ve molekül ağırlığı, tek bir bant olarak 50.1 kDa bulunmuştur. Otimum pH, ısı ve iyonik güç, sırasıyla 7.85, 60°C and 100 mM olarak bulunmuştur. Enzimin aktivasyon enerjisi 17.37 kkal/mol’dür. 6PGA ve NADP+ ’nin Km değerleri sırasıyla, 169.3 µM ve 91.1 µM olarak ve Vmax değerleri sırasıyla 5.1096 U/mg ve 6.6776 U/mg olarak gösterilmiştir. 6PGD, NADPH tarafından 41.5 µM Ki değeri ile kompetatif olarak inhibe edilmektedir. Cd2+, Cu2+ ve Al3+’un enzim üzerine inhibisyon etkileri gösterilmiştir. Enzimi Cd2+ kompetatif olarak inhibe etmektedir. Cd2+ ve Cu2+’ın IC50 değerleri sırasıyla 0.16, 0.41mM olarak bulunmuştur. Al3+’ün enzim aktivitesi üzerine bir etkisi gözlenmemiştir. Sonuç: Çalışma balık 6PGD’sinin saflaştırılması ve kinetic özelliklerinin incelenmesi bakımından daha içerikli bir bilgi sunmaktadır. Balık 6PGD’si üzerine in vitro şartlarda metal iyonlarının etkisinin incelendiği ilk çalışmadır.

Yazarlar:
Meiqin ZHUO Zhi LUO Xiaying TAN Wei HU Lindan SUN Jialang ZHENG Qiliang CHEN
Meiqin Zhuo, Zhi Luo, Xiaoying Tan, Wei Hu, Lindan Sun, Jialang Zheng, Qiliang Chen

Anahtar Kelimeler : Pelteobagrus fulvidraco; 6PGD; purification; kinetic characterization; metal ions inhibition,Pelteobagrus fulvidraco; 6PGD; saflaştırma; kinetic karekterizasyon; metal iyon inhibisyonu

Dönem : 2015 | Cilt : 40 | Seri : 1 | Sayfalar : 15-23 | Doi : 10.5505/tjb.2015.75537

Okuma : 159 | İndirme : 149 | Yayınlama :